Járványügyi tipizálás DNS szekvencia (bázissorrend) meghatározásával PCR alapú reakcióval

 

A vizsgálat alkalmazási területe

Kórházi fertőzésekből valamint a kórházi környezetből esethalmozódás, járvány esetén kitenyésztett baktérium törzsek járványügyi vizsgálata. Klinikailag összefüggő esetek (legalább kettő) közötti járványügyi összefüggés igazolása vagy kizárása (terjedés betegről betegre, betegből környezetre, majd újabb betegre). A DNS szekvencia minden olyan információt közvetlenül tartalmaz, amelyet egyéb módszerek alkalmazásával csak korlátozott mértékben és közvetve nyerhetünk: a DNS szekvenciák összehasonlítása alapján minden mutáció típus detektálható (szekvencia tipizálás).

Vizsgálataink:

  • Klebsiella pneumoniae MLST
  • Staphylococcus aureus törzsek spa tipizálása
  • Streptococcus pyogenes emm gén tipizálása
  • ESBL gének szekvenciatípusának meghatározása

A vizsgálat célja

Bizonyos génszakaszok bázissorrendjének (szekvencia) meghatározása. Ennek alapján

szekvencia tipizálás:

  • repetitív (ismétlődő) szekvenciák számának és méretének meghatározása,
  • klonalitás vizsgálata - Magyarországon előforduló nemzetközi klónok, vagy magyar klónok feltérképezése,
  • egyéb genetikai sajátosságok vizsgálata.

A kapott bázissorrend alapján meghatározott típusról, altípusról a beküldőt, valamint, ha ettől különböző, az illetékes járványügyi szakembert leletben tájékoztatjuk.

A vizsgálat elve:

A tisztított templát DNS szekvenálásra szánt régióját PCR reakció segítségével sokszorosítjuk (amplifikálás), az amplikont tisztítjuk. A szekvenálási reakció előtt a DNS preparálás, a PCR reakció, valamint az amplikon tisztítási folyamatát agaróz gélelektroforézissel ellenőrizzük. A szekvenálási reakció szintén PCR alapú (ciklikus szekvenálási reakció). A ciklusok során a reakció specifikus polimeráz enzim a templát DNS szál mellé a szekvenáló primer segítségével a kettősen jelölt dideoxy nukleotidok (úgy nevezett terminátor molekulák) felhasználásával a reakció során egyre növekvő hosszúságú molekulákat szintetizál: a terminátor molekulák a keletkező amplikonokat lezárják, a szintézis a jelölt nukleotidok beépülésével megszakad. A készülék által végzett automatikus kapilláris gélelektroforézis (mikro PAGE) során történő szeparálás után következik a szintén automatizált detektálás. Ehhez szükséges a kettősen jelölt terminátor molekulák alkalmazása: a lézer fény hatására gerjesztődő fluoreszcein molekulák energia transzfer útján gerjesztik a nukleotid specifikus rodamin festék molekulákat, amik karakterisztikus hullámhosszú fényt emittálnak, ilyen módon identifikálva a vizsgálandó DNS szakasz minden egyes nukleotidját (szekvencia chromatogram). A kettős jelölés megnöveli a módszer érzékenységét és specificitását. Így akár 1000 bázis hosszúságú DNS szakasz bázis sorrendje is meghatározható 2-3 óra alatt. Az adatok kiértékelését, a szekvenciák meghatározását, tárolását szoftver végzi. A kapott szekvenciákat a vizsgálat típusának megfelelő adatbázisokhoz hasonlítjuk: szekvencia típus meghatározás. A PCR mix, a szekvenálási reakció, a szeparálás (és így a kapillárisok állapota), valamint a detektálás folyamatának ellenőrzése a gyártó által biztosított referencia anyag (M13 jelű tisztított templát DNS) vizsgálatával történik.

Fogalom meghatározások, alkalmazott rövidítések

  • MLST: Az MLST (multilocus sequence typing = multilocus szekvencia tipizálás) olyan nukleotid bázissorrend meghatározáson alapuló szekvencia tipizáló módszer, ahol több, különböző (általában 7) housekeeping gén részét képező, a kromoszómán egymástól távol levő locus nukleotid bázissorrend meghatározását végezzük el. Az összes nukleotidot legalább két szekvencia chromatogram készítésével azonosítjuk (legalább két párhuzamos vizsgálat). A szekvencia típus meghatározása úgy történik, hogy minden egyes észlelt nukleotid különbséghez egy (az előzőektől különböző) allélszámot rendelünk locusonként (az allélek tehát locusonként, az észlelési sorrendnek megfelelően növekvő sorrendben számozódnak). Szekvencia típus számot (ST) kap minden egyes (az előzőektől különböző) allél kombináció. Az allél szekvenciák és az eddig ismert szekvencia típusok elérhetőek egy publikus MLST web oldalon. Az adatbázissal való összehasonlítás eredményeként a vizsgált törzs MLST típusa meghatározható. Klebsiella pneumoniae törzsek MLST vizsgálatával eddig (2006) 146 típust határoztak meg a világon. Vizsgálatainkat a Bakteriológia I. Osztályon működő ESBL Referencia Laboratóriummal közösen végezzük.
  • spa tipizálás: A spa-tipizálás során a S. aureus törzsek protein A-t kódoló gén (spa) polimorf régiójának (X régió) szekvenálása történik. A polimorf X régió különböző számú és bázis sorrendű rövid szekvencia ismétlődéseket (SSR) tartalmaz, a különbözőséget (spa típusok) duplikációk, deléciók, pontmutációk okozzák. A nemzetközi adatbázis adatai szerint eddig (2006) 1888 típust írtak le a világon.
  • emm gén tipizálás: Az emm gén kódolja a Streptococcus pyogenes törzsek sejtfelszíni M virulencia fehérjéjét, amely protein diverzitása alapján több mint 100 szerotípust különböztettek meg. Az emm gén PCR technikával történő felamplifikálása lehetővé teszi a gén azon szakaszának szekvencia analízisét, amely kódolja az M protein szerospecifikus, hypervariábilis részét. Az emm gén szekvencia tipizálása során a szignálpeptid utáni 150 bázispárnyi szakasz bázis sorrendje alapján azonosítjuk a típusokat. A nemzetközi adatbázis adatai szerint eddig (2005) 124 emm típust azonosítottak a világon. A módszer kiváltja az M protein szerotipizálását, ami problematikus volt a tipizáló savók korlátozott hozzáférhetősége, újabb és újabb szerotípusok megjelenése, valamint az eredmények interpretálásával kapcsolatos nehézségek miatt.
  • ESBL gének szekvenciatípusának meghatározása: A széles spektrumú b-laktám antibiotikumokat cefotaxime bontó enzimeket (ESBL) kódoló gének szekvencia tipizálása. Vizsgálatainkat a Bakteriológia I. Osztályon működő ESBL Referencia Laboratóriummal közösen végezzük.

 

 

A vizsgálat eredményét, annak értékelését bemutató ábra:

A gyártó által biztosított, M13 jelű referencia anyag szekvencia chromatogramját bemutató ábra a Képek menüpont alatt található.


A cikk oldalai:  1  2  3  4  5  6  7 

    Tevékenységi kör

    Kapcsolatfelvétel

    Munkatársaink

    Vizsgálataink

    Módszereink rövid leírása

    Tudományos Tevékenység

    Oktatás, továbbképzés

    Vizsgálatkérő lap

S. pyogenes bekérőlap
ESBL izolátumok bekérőlapja
MRSA bekérőlapok
 

    Képek